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虾苗厂藻类三级培养技术,看看育苗得下多少工夫

编辑:九五至尊娱乐水产    发布时间:2016-11-06    浏览:746次

对虾种苗企业的生存主要是依靠虾苗养殖效果来决定的,虾苗成活率的高低直接影响着产业链的上上下下。单胞藻对于虾苗早期是最适合的饵料,如果培育得当,不仅可以节约成本,减少育苗水体环境负荷,尤其是对于虾苗的发育打下坚实的基础,提高成活率。结合个人的育苗感受,投喂单胞藻与不投喂的区别还是有的,比如苗的变态时间缩短,活力个头大小,水质均优于未投喂单胞藻的苗,当然如果培育不得当,反作用也有,比如投喂有害菌超标的藻液,藻类老化,投喂过量等。所以合理运用,方可收到理想效果。限于个人水平,描述方法的错误不足之处,恳请大家指正。

一 、单胞藻纯培养室操作描述

仪器使用

(1) 超净工作台

使用前提前开机,打开紫外线灯和风机开关20分钟。超净台面上不存放不必要的物品,保持工作区内的净化气流不受干扰,工作时尽量避免作明显干扰气流的动作;超净台保持光滑水平,光滑便于用酒精消毒布擦,水平是倒培养基时使培养皿内平板厚度一致。工作时超净台周围空气流动要缓慢,杂菌尽量减少,所以要定期清洁消毒保种室内,关闭门窗,尽可能减少杂菌数量;空气过滤网定期清洁。

(2)真空泵和溶剂过滤器及过滤膜

此环节过滤只是为单胞藻纯培养室(保种,提纯,扩培试管级)准备清洁无菌海水。其他级别的培养无需此环节。

过滤膜使用0.2微米孔径,不可用手拿,用镊子选取。真空泵与溶剂过滤器之间通过合适口径的橡胶管连接紧密,每次过滤要注意滤膜的过滤效果,防止滤孔阻塞影响过滤效果。滤瓶内的滤液不能没过滤板出水口,否则滤液将被抽吸入真空泵,导致真空泵损坏。

应该使滤板内的营养液过滤尽后(无水滴)才能停泵。要定期注意真空泵内油量,注意加油。

(3) 恒温鼓风干燥箱

设定温度时。先按控温仪功能键SET进入温度设定状态,此时SP设定显示一闪一闪,要按移动位键配合加键或减键,设定时先从分位数字设定,一直到百位数,设定结束需按一下功能键SET,此时干燥箱进入升温状态,加热指示灯亮,当箱内温度接近设定温度时,加热指示灯闪动多次,控制进入恒温状态。

使用注意事项:物品不能堆得太满,更不能堵住出风口,以免影响温度均匀上升。若是有牛皮纸和保鲜膜时,温度不能超过180度。取出物品时,箱内外温差不宜过高,防止玻璃器皿炸裂。橡胶制品不能放入。

(4)加湿器

配合生化培养箱使用。

水源是蒸馏水;不应容器内带水移动加湿器;加水时应在容器上表示的满水线为止。

应注意的事项:平时留意观察水箱的存水量,及时予以补充,远离热源,腐蚀物。

(5)蒸汽消毒器

容器加水时,水位一定要超过电热管,最好是到3个支撑点的下缘,如果连续使用,应在每次消毒前补足蒸发水量,不然少水会烧坏电热管。盖上的放气软管插入消毒桶圆槽内,对正盖和主体的螺栓槽,依次将相对方的翼型螺母予以旋紧,使盖与主体密合,加热开始时,应将放气阀与安全阀的小手柄扳至垂直放气方位,必须待有较急蒸汽喷出,即将小手柄扳回水平“关闭”方位。

当到达所需压力和温度,计算消毒时间,消毒毕后,关闭电源,待压力指针指向0时,将放气阀的小手柄扳至垂直放气方位,气放完后,打开容器盖。物品消毒后要迅速干燥。

应注意灭菌液体时,不超过盛液体容器体积的3/4,瓶塞不可用软木塞或未打孔的橡胶塞。灭菌器内冷空气必须完全排除。因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压,当水蒸气含冷空气时,压力表所表示的压力是水蒸气压力和部分冷空气压力之和,不是水蒸气的实际压力,而同一压力下的实际温度,含空气的蒸汽低于饱和蒸汽,这样导致达不了消毒效果。绝不可堵塞安全阀出气孔,必须留空位保证其畅通放气,发现超温超压,立即断电。

蒸馏器

先关闭放水阀,打开进水阀,待溢水皮管有水流出,方可接通电源,此时可暂时关闭进水阀,待出水皮管有蒸馏水流出,打开进水阀,制备蒸馏水。定期清洗蒸馏器内壁,除去水垢,不然影响蒸馏水质量和使用效果。切不可关闭水阀制备蒸馏水,否则烧坏电热管。

(6)鼓风机

定期更换吸气口的过滤棉,异常情况,请电工检查。

(7)空调

保种室若有生长藻种,需维持恒定温度,反之关闭。一级,二级空调视外界气温调整开关。

二 、卫生消毒

工具卫生消毒

1、滤水筒式过滤器。筒式过滤器的滤芯应用一次更换一次,用过的滤芯浸泡在1%盐酸溶液中消毒12h以上。然后用洗洁精清洗,再用足量清水冲洗干净,晾干备用。(滤芯规格应小于等于0.5微米)。

2、试管(规格10毫升到20毫升),锥形瓶(50毫升到200毫升),500ml锥形瓶,2.5L瓶广口瓶,移液管,移液枪管/盒,玻璃气管,胶气管,气石,溶剂过滤器,培养皿。用过后应当用清水清洗后浸泡于1% 盐酸12h以上(溶剂过滤器除外,浸泡时相近大小器皿分类放不同的消毒桶,规格相差大,易导致相互碰撞碎烂)然后用洗洁精清洗(用毛刷清洗试管底部时,不可太用力,否则底部易破裂),再用大量清水冲洗干净,风干或晒干,高压灭菌后,放入恒温干燥箱(胶气管,气石除外)干燥备用。

3、聚乙烯藻袋用于二级藻类藻种挂袋培养或3级扩培(一般使用盛装藻液12升左右)。先用清水冲洗干净内外,浸泡于1% 盐酸12h以上,再用大量清水冲洗干净,风干或晒干,备用。由于藻袋近似密封性,对于防止微生物污染有很好的效果。

4、毛巾、保种室,一级和二级毛巾不可混用,所用毛巾后都应消毒清洗晾干后备用。

5、锡箔纸:除非粘上油污或污物以及破损,都应重复使用。

6、牛皮纸:定期拿到烘箱烘干。

7、定期更换空气过滤器(用于1,2级培养的进气过滤)的滤芯,滤芯已油化或冲散的弃去。

8、定期更换鼓风机进风口的过滤棉。

9、对新购入的器皿应先除去包装沾染的污垢后,用洗洁精刷洗,流水冲净,再浸泡于1%的盐酸12h,使游离的碱性物质除去,再用清水冲洗干净,风干或晒干备用。

室内卫生消毒

1、保种室每天早上用清水擦洗实验台面,地板,墙壁,木架后,开紫外灯消毒20分钟,此时关掉空调,关掉日光灯,由于紫外灯照射会产生一定量的臭氧,对人体有害,所以消毒关闭紫外灯后人应隔一段时间再进去。进保种室换鞋。

2、一级和二级室每天清洁,接种前接种后承载物框架都应用消毒液消毒。

3、门口消毒池定期更换消毒药水(高锰酸钾)。

4、常用消毒剂浓度 1%盐酸,次氯酸钠20ppm(有效氯),碘液(1000ppm),酒精70-75%,高锰酸钾1mg/L。

三 、接种

藻种固体培养基制备

所需烧杯,玻棒须清洗干净,锥形瓶和培养皿须消毒清洗灭菌烘干。将称好的纯化琼脂粉加入烧杯再加入一定量的海水,加热(必须不停搅拌,以免琼脂糊底烧焦)至完全融化,加热后的琼脂培养基应当透明无显著沉淀,若明显,可采用清洁的白色薄绒布或中间夹有薄层吸水棉的双层纱布铺在漏斗上趁热过滤,融化毕后精确加入营养盐(维生素B溶液须等培养基高压灭菌后冷却至50摄氏度以下再加)。

培养基采用121摄氏度高压蒸汽灭菌20至30分钟即可,培养基灭菌后应立即取出,冷却至50摄氏度以下,即加维生素B溶液。将盛装培养基的锥形瓶和培养皿放在超净工作台上,点燃酒精灯,右手托起锥形瓶底,将瓶口在酒精灯稍加烧,然后迅速将培养基倒入培养皿中,以铺满皿底为止(厚薄适中)。铺放好后,放置20-30分钟,待培养基凝固后,即开始操作。

若是做斜面培养基,则加入维生素B溶液后,将盛装培养基的锥形瓶和试管以及一根厚约1厘米的小木板放在超净工作台上。分装约为试管高度的1/3-2/3(视情况操作),分装量应以能形成2/3底层和1/3斜面量为好,摆置成适当斜面,待其自然凝固。培养基制备好后,如发现破裂,水分浸入,色泽异常等均应弃去.

待凝固后即进行操作,现一般采用平板划线接种和涂布接种。

平板划线接种

接种环在酒精灯火焰上充分烧红后,接种柄一边转动一边慢慢来回通过火焰3次,待冷却至室温方可挑取藻种(为保证藻种不被烫死,挑种前可将接种环接触培养皿内壁或培养基),迅速接种至新培养基(划线可采用斜线法,方格法,曲线法,放射法等)。左手握住平板,用大拇指和食指稍稍抬起皿盖,同时靠近火焰周围,右手持接种环伸入皿内,在平板上一个区域作划线(依方法不同,动作不同)。划线时使接种环与平板表面成30-40度角轻轻接触,以腕力在表面作较快的滑动(注意不要划破平板表面或伸进培养基内)。接种环挑种后和划线完抽出时均不可碰及皿壁/口,更不能碰其它物体和台面。接种完后,将接种环从柄部至环端逐渐通过酒精灯火焰灭菌,不能直接烧环,以免残留在接种环上的藻体或菌体爆溅污染空间。上述操作完成后,即用无菌封口膜封培养皿口(膜使用前须用酒精消毒,紫外灯消毒,风干),封口时,用左手大拇指摁住膜一边末端,右手大拇指和食指捏住另一边末端,迅速绕培养皿口绕一圈,封口。

涂布接种

所用种液必须经过弧菌检测合格后方可使用。涂布棒在火焰上慢慢来回过火焰3次,冷却(不可骤冷),将种液用移液枪从试管吸出注入平板上面(枪管不可碰及试管外壁,更不能碰及其它物品或台面),迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布,让藻液分布均匀,毕后,封口同平板划线。

试管液体培养基接种

所用种液必须经过弧菌检测合格后方可使用。火焰灭菌前试管口外壁不能有水滴(易导致受热不均而破裂),烧试管口时,试管倾斜45度角,不断移动试管,使试管口受热均匀,灭菌时间3秒左右。灭菌后不能骤冷,防止试管破裂。毕后,用盛装营养液150或200ml的锥形瓶(也要灭菌瓶口)向试管中倾倒营养液,每次只能拿一个试管(注:若几个试管对比时,可以同时拿在手里,用大拇指和手掌),倒好后,同样试管和锥形瓶口灭菌,试管塞也要灭菌,塞试管塞时不要移动试管迎接塞,以免试管在移动中纳入可能含菌空气,火焰旁为无菌。

所有试管分装好后,即接种。用移液枪选取移液量(试管口灭菌),注入新培养基,枪管不可碰及管外壁,更不能碰及其它物品或台面,一支枪管只能和同一种液使用,选取另一试管种液时必须更换枪头。接种毕后,选取合适光照温度培养。由于试管培养是静置培养,而在静置条件下,藻细胞会聚集在试管底部,且藻细胞周围会形成透过养分的屏障,营养盐的摄入受阻,光照吸收不均,为使营养盐摄入正常,藻细胞受光均匀,需要定时摇置试管(手先喷消毒酒精,手腕使劲摇,不要摆臂,不能倒置摇)

三角瓶,500ml瓶,2.5L瓶液体培养基接种

三角瓶接种需无菌操作。500ml瓶,2.5L瓶液体培养基接种均在室内卫生条件下操作。3种瓶和所需营养液及锡纸,移液管,洗耳球,气管,气石均需经消毒清洗,灭菌后使用。三角瓶需定时摇置,500ml,2.5L瓶培养在通气条件下培养。

二级聚乙烯藻袋液体培养基接种

气管,气石均需经消毒清洗,灭菌后使用,抽藻管前次用毕后应当用水泵将管内灌满消毒盐酸溶液,今次用前需用海水或淡水冲洗干净后使用。选取的种液应当是无明显沉淀,泡沫,原生动物,附着物,色泽正常,藻细胞密度大,形态正常,弧菌检测合格后选用。所用海水漂白水消毒有效氯应足10ppm,曝气12小时,检测余氯,加硫代硫酸钠中和,方可使用。若使用稀释的漂白水,应当天配制当天使用,而未使用的要在24小时后弃去。且稀释的漂白水必须加盖放在避光的容器内保存。由于漂白水会随时间渐渐分解,一次性购入的漂白水不应太多,不要过量储存,以免影响灭菌功效。

1,2,3级接藻示意

试管→三角瓶→500ml瓶子→2500ml瓶子→20升的藻种聚乙烯袋 →18升的扩培藻聚乙烯袋或者培藻池

相关说明

1、母液的配置可以参考教科书上所写,然后结合当地的水质适当修改即可。氮,磷,铁元素,维生素B1,B12是必须使用,维生素母液保存于低温弱光环境下,其中维生素的添加需要先高压灭菌后再加入母液中。其余营养盐先配置好后,再灭菌。如果是硅藻类,还应加上硅酸钠。

2、保种室所需营养液(母液千分之0.8的比例添加)除需高压灭菌外还必须经过真空泵抽滤后才能用,微孔滤膜直径为50毫米,孔径为0.2微米。

3、接种比例A:试管0.07—0.09(随密度大小变化),10毫升试管加营养液7毫升,藻种0.5毫升,20毫升试管中营养液加12.5毫升营养液,1毫升藻种。B:三角瓶0.09-0.11。在100毫升,150毫升,200毫升,250毫升三角瓶中分别加营养液,70,80,120,150毫升(可按一试管对应一个三角瓶加入),C: 500毫升瓶(400毫升营养液)(按1个三角瓶对应1个500毫升瓶加入)D:2.5升瓶(2升营养液)(按1个500毫升瓶对应1个2.5升瓶加入),注意:上述若发现藻生长情况不好,需要先镜检,判断后再决定是否接种。

一般情况下3袋二级藻种应先扩培接种于容量400升的桶(海水贮备及营养液提前配置好),然后立即进行二级藻袋扩种,每个聚乙烯袋加18升左右藻水。

4、保种培养基制备:按1.5%的比例加琼脂粉,煮沸后加营养盐(母液千分之1添加),高压灭菌。维生素需高压灭菌后培养基冷却至30摄氏度方可加入。(可用划线法,涂布法等分离培养藻种)。

5、仪器的清洗维护。溶剂过滤器使用后只用洗洁精和清水清洗。高压灭菌后备用。其它玻璃仪器,气管,气石,移液枪筒使用后需要浸泡在百分之一到百分之十的稀盐酸溶液中至少半天,才能拿出清洗,风干,高压灭菌后备用。

说明:10的2次方标示成10^2,以下数字的次方通用此表示法

三级藻生产

三级藻系统包括用水处理以及配送,温度与光照控制,藻种的供应等。为确保扩大培养成功,从接种到收获的培养时间应该尽量缩短,以避免因为开放式培养随培养规模扩大接触外界感染源时间加长,三级藻池滋生过多的有害生物,使三级培养失败。

1—1高水位低密度接种(接种密度为P×10^4cell/ml,P为接种密度万位数值)(未特别说明藻水藻细胞密度就是cell/ml)(以下的推理是建立在三级藻第二次加水和收获的密度为105级)

若一天三级浓缩藻需求量为A升,则总藻细胞数目为K=A×10^3×(B×10^7)cell(K为A升浓缩藻所含的藻细胞数值,B为浓缩藻密度千万位的数值),一般情况下二级藻种的密度为C×10^6cell/ml(C为二级藻密度百万位的数值),若第一天接种E吨藻水,则一天需要二级藻种体积d=E×10^6×P×104/C×10^6=EP×10/C升,第三天加水F吨,此时加水后藻水密度E×10^6×Y×10^5/(E+F)×10^6cell/ml(Y为第三天加F吨水之前藻水密度十万位数值),然后第五天收获时,藻池藻水藻细胞总数目应为H=(E+F)×10^5×Z×10^6(Z为藻池藻水密度十万位数,H为藻池藻水藻细胞总数目),因为总需求量的藻细胞数目应等于最后藻池藻水藻细胞总数目,则K=H,则A×10^3×B×10^7=(E+F)×10^6×Z×10^5经过计算是A×B=(E+F)×10×Z。

举例

若一天需浓缩藻320升,则A=320,(一般情况下E和F的值接近),则因为K=H,所以320×B=20EZ,即320B=20EZ,E=16B/Z,即B/Z吨藻池藻水可以收集浓缩藻20升(B为浓缩藻密度千万位的数值,Z为藻池藻水密度十万位数),即若一天需要浓缩藻A升,则每天应接种E=AB÷20Z吨水。(Z和B的值应经过三级培养和收集藻水后才知道近似数值)。

1—2高水位低密度接种(接种密度为P×10^4cell/ml,P为接种密度万位数值)(未特别说明的藻水藻细胞密度就是cell/ml)(以下的推理是建立在三级藻第二次加水和收获密度为10^6级)。

若一天三级浓缩藻需求量为A升,则总藻细胞数目为K=A×10^3×(B×10^7)cell (K为A升浓缩藻所含的藻细胞数值,B为浓缩藻密度千万位的数值),一般情况下二级藻种的密度为C×10^6cell/ml(C为二级藻密度百万位的数值),若一天接种E吨藻水,则一天需要二级藻种体积d=E×10^6×P×10^4/C×10^6=EP×10/C升,第三天加水F吨,此时加水后藻水密度E×10^6×Y×10^6/(E+F) ×10^6 cell/ml(Y为第三天加F吨水之前藻水密度百万位数值),然后第五天收获时,藻池藻水藻细胞总数目应为H=(E+F)×10^6×Z×10^6 (Z为藻池藻水密度百万位数,H为藻池藻水藻细胞总数目),因为总需求量的藻细胞数目应等于最后藻池藻水藻细胞总数目,则K=H,则 A×10^3×B×10^7 =(E+F)×10^6×Z×10^6经过计算是A×B=(E+F) ×100×Z, (一般情况下E和F的值接近),则近似AB=200EZ, 即若一天需要浓缩藻A升,则每天应接种E=AB÷200Z吨水。(Z和B的值应经过三级培养和收集藻水后才知道近似数值)。

2—1低水位高密度接种(接种密度为P×10^5cell/ml,P为接种密度十万位数值)(未特别说明藻水藻细胞密度就是cell/ml)(以下的推理是建立在三级藻第二次,第三次加水和收获的密度为105级)。

若一天三级浓缩藻需求量为A升,则总藻细胞数目为K=A×10^3×(B×10^7)cell (K为A升浓缩藻所含的藻细胞数值,B为浓缩藻密度千万位的数值),一般情况下二级藻种的密度为C×10^6cell/ml(C为二级藻密度百万位的数值),若第一天接种E吨藻水,则一天需要二级藻种体积d=E×10^6×P×10^5/C×10^6=EP×100/C升,第二天加水F吨,此时加水后藻水密度E×10^6×Y×10^5/(E+F)×10^6cell/ml(Y为第二天加F吨水之前藻水密度十万位数值),然后第三天加水G吨时,藻池藻水藻细胞密度应为J=(E+F)×10^6×Z×10^5/(E+F+G)×10^6(Z为藻池藻水密度十万位数),第四天或第五天收获时,藻池藻水藻细胞总数目应为H=(E+F+G)×10^6×W×10^5(W为藻池藻水密度十万位数,H为藻池藻水藻细胞总数目),因为总需求量的藻细胞数目应等于最后藻池藻水藻细胞总数目。

则K=H,则A×10^3×B×10^7=(E+F+G)×10^6×W×10^5经过计算是A×B=(E+F+G) ×10×W,

(一般情况下E,F,G的值接近),则近似AB=30EW, 即若一天需要浓缩藻A升,则每天应接种E=AB÷30W吨水。(W和B的值应经过三级培养和收集藻水后才知道近似数值)。

2—2低水位高密度接种(接种密度为P×10^5cell/ml,P为接种密度十万位数值)(未特别说明藻水藻细胞密度就是cell/ml)(以下的推理是建立在三级藻第二次,第三次加水和收获的密度为10^6级)。

若一天三级浓缩藻需求量为A升,则总藻细胞数目为K=A×10^3×(B×10^7)cell (K为A升浓缩藻所含的藻细胞数值,B为浓缩藻密度千万位的数值),一般情况下二级藻种的密度为C×10^6cell/ml(C为二级藻密度百万位的数值),若一天接种E吨藻水,则一天需要二级藻种体积d=E×10^6×P×10^5/C×10^6=EP×100/C升,第二天加水F吨,此时加水后藻水密度E×10^6×Y×10^6/(E+F)×10^6cell/ml(Y为第二天加F吨水之前藻水密度百万位数值),然后第三天加水G吨时,藻池藻水藻细胞密度应为J=(E+F)×10^6×Z×10^6/(E+F+G) ×10^6 (Z为藻池藻水密度百万位数),第四天或第五天收获时,藻池藻水藻细胞总数目应为H=(E+F+G)×10^6×W×10^6 (W为藻池藻水密度百万位数,H为藻池藻水藻细胞总数目),因为总需求量的藻细胞数目应等于最后藻池藻水藻细胞总数目,则K=H,则A×10^3×B×10^7=(E+F+G)×10^6×W×10^6经过计算是A×B=(E+F+G) ×10×W。(一般情况下E,F,G的值接近),则近似AB=300EW, 即若一天需要浓缩藻A升,则每天应接种E=AB÷300W吨水。(W和B的值应经过实地三级培养和收集藻水后才知道近似数值)。

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